Hollandske forskere kombinerer CRISPR og bioluminescens i en eksperimentel test forinfektionssygdomme

Et nyudviklet natligt protein kunne fremskynde og forenkle diagnosen af ​​virussygdomme, ifølge forskere i Holland.
Deres undersøgelse, offentliggjort onsdag i ACS Publications, beskriver en følsom, et-trins metode til hurtigt at analysere virale nukleinsyrer og deres udseende ved hjælp af lysende lyse blå eller grønne proteiner.
Identifikation af patogener ved at påvise deres nukleinsyrefingeraftryk er en nøglestrategi i klinisk diagnostik, biomedicinsk forskning og overvågning af fødevare- og miljøsikkerhed.De udbredte kvantitative polymerasekædereaktions (PCR)-tests er meget følsomme, men kræver sofistikeret prøveforberedelse eller fortolkning af resultater, hvilket gør dem upraktiske for nogle sundhedsmæssige indstillinger eller ressourcebegrænsede indstillinger.
Denne gruppe fra Holland er resultatet af et samarbejde mellem forskere fra universiteter og hospitaler om at udvikle en hurtig, bærbar og letanvendelig nukleinsyrediagnosemetode, der kan anvendes i en række forskellige miljøer.
De var inspireret af ildflueglimt, ildflue-glød og små stjerner af akvatisk fytoplankton, alle drevet af et fænomen kaldet bioluminescens.Denne glød-i-mørke-effekt er forårsaget af en kemisk reaktion, der involverer luciferaseproteinet.Forskerne inkorporerede luciferaseproteiner i sensorer, der udsender lys for at lette observation, når de finder et mål.Selvom dette gør disse sensorer ideelle til point-of-care-detektion, mangler de i øjeblikket den høje følsomhed, der er nødvendig for kliniske diagnostiske tests.Mens CRISPR-genredigeringsmetoden kan give denne mulighed, kræver det mange trin og yderligere specialiseret udstyr til at detektere det svage signal, der kan være til stede i komplekse, støjende prøver.
Forskere har fundet en måde at kombinere et CRISPR-relateret protein med et bioluminescerende signal, der kan detekteres med et simpelt digitalkamera.For at sikre, at der var nok RNA- eller DNA-prøve til analyse, udførte forskerne rekombinasepolymerase-amplifikation (RPA), en simpel teknik, der fungerer ved en konstant temperatur på omkring 100°F.De udviklede en ny platform kaldet Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), hvor de to CRISPR/Cas9-proteiner er specifikke for forskellige sammenhængende dele af det virale genom, hver med et unikt luciferasefragment knyttet til dem ovenfor.
Når det specifikke virale genom, som efterforskerne undersøger, er til stede, binder to CRISPR/Cas9-proteiner til målnukleinsyresekvensen;de bliver i umiddelbar nærhed, hvilket tillader intakt luciferaseprotein at danne og udsende blåt lys i nærvær af et kemisk substrat..For at tage højde for det substrat, der forbruges i denne proces, brugte forskerne en kontrolreaktion, der udsendte grønt lys.Et rør, der skifter farve fra grønt til blåt, indikerer et positivt resultat.
Forskerne testede deres platform ved at udvikle RPA-LUNAS-analysen, som detektererSARS-CoV-2 RNAuden kedelig RNA-isolering og demonstrerede sin diagnostiske ydeevne på nasopharyngeale podningsprøver fraCOVID-19patienter.RPA-LUNAS påviste med succes SARS-CoV-2 inden for 20 minutter i prøver med en RNA-virusbelastning så lav som 200 kopier/μL.
Forskerne mener, at deres assay nemt og effektivt kan opdage mange andre vira."RPA-LUNAS er attraktiv til point-of-care test af infektionssygdomme," skrev de.